يُعدّ IPTG (أيزوبروبيل-β-D-ثيوغالاكتوزيد) نظيرًا لركيزة β-غالاكتوزيداز، وهو قابل للتحفيز بدرجة عالية. عند تحفيزه بواسطة IPTG، يُمكن للمُحفِّز تكوين مُركَّب مع البروتين الكابت، مما يُغيِّر من بنيته، فلا يستطيع الارتباط بالجين المستهدف، وبالتالي يُعبَّر عن الجين المستهدف بكفاءة. فكيف يُمكن تحديد تركيز IPTG خلال التجربة؟ هل التركيز الأعلى أفضل؟
لنبدأ بفهم مبدأ تحفيز IPTG: يحتوي أوبيرون اللاكتوز (العنصر) في بكتيريا الإشريكية القولونية على ثلاثة جينات بنيوية، Z وY وA، تُشفّر على التوالي إنزيمات بيتا-جالاكتوزيداز، والبيرميز، وأسيتيل ترانسفيراز. يقوم الجين lacZ بتحليل اللاكتوز إلى جلوكوز وجالاكتوز، أو إلى ألو-لاكتوز؛ بينما يسمح الجين lacY للاكتوز الموجود في البيئة بالمرور عبر غشاء الخلية ودخولها؛ أما الجين lacA فينقل مجموعة الأسيتيل من أسيتيل-CoA إلى بيتا-جالاكتوزيد، مما يُزيل التأثير السام. إضافةً إلى ذلك، يوجد تسلسل تشغيل O، وتسلسل بدء P، وجين تنظيمي I. يُشفّر الجين I بروتينًا كابحًا يرتبط بالموقع O في تسلسل التشغيل، مما يؤدي إلى كبح الأوبيرون (العنصر) وإيقافه. يوجد أيضًا موقع ارتباط لبروتين تنشيط الجينات الهدمية (CAP) في المنطقة المجاورة لتسلسل البدء P. يشكل تسلسل P وتسلسل O وموقع ارتباط CAP معًا المنطقة التنظيمية لأوبيرون اللاكتوز. تُنظَّم الجينات المشفرة للإنزيمات الثلاثة بواسطة نفس المنطقة التنظيمية لتحقيق التعبير المنسق لمنتجات الجينات.
في غياب اللاكتوز، يكون أوبيرون اللاكتوز (ميتا) في حالة كبت. في هذه الحالة، يرتبط مثبط اللاكتوز، المُعبَّر عنه بواسطة التسلسل I تحت سيطرة تسلسل المحفز PI، بالتسلسل O، مما يمنع بوليميراز الحمض النووي الريبي من الارتباط بالتسلسل P، وبالتالي يثبط بدء النسخ. عند وجود اللاكتوز، يمكن تحفيز أوبيرون اللاكتوز (ميتا). في هذا النظام، لا يُعد اللاكتوز نفسه المحفز الحقيقي. يدخل اللاكتوز إلى الخلية، ويُحفزه إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز ليتحول إلى ألولاكتوز. يرتبط الألولاكتوز، كجزيء محفز، ببروتين الكابت، ويُغير بنيته، مما يؤدي إلى انفصال بروتين الكابت عن التسلسل O وبدء النسخ. يُحدث إيزوبروبيل ثيوجالاكتوزيد (IPTG) نفس تأثير الألولاكتوز. إنه محفز قوي للغاية، لا يتم استقلابه بواسطة البكتيريا وهو مستقر للغاية، لذلك يتم استخدامه على نطاق واسع في المختبرات.
كيف نحدد التركيز الأمثل لـ IPTG؟ لنأخذ بكتيريا الإشريكية القولونية كمثال.
تم تلقيح سلالة الإشريكية القولونية BL21 المعدلة وراثيًا، الحاملة للبلازميد المؤتلف الموجب pGEX (CGRP/msCT)، في وسط سائل LB يحتوي على 50 ميكروغرام/مل من الأمبيسيلين، وحُضنت طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم نُقلت هذه المزرعة إلى 10 زجاجات من وسط سائل LB طازج سعة 50 مل، يحتوي كل منها على 50 ميكروغرام/مل من الأمبيسيلين، بنسبة 1:100 لتوسيع المزرعة. وعندما بلغت قيمة الامتصاص الضوئي عند 600 نانومتر (OD600) ما بين 0.6 و0.8، أُضيف IPTG بتراكيز نهائية قدرها 0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، 0.6، 0.7، 0.8، 0.9، و1.0 ملي مول/لتر. بعد التحفيز عند نفس درجة الحرارة ونفس الوقت، تم أخذ 1 مل من المحلول البكتيري منه، وتم جمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي وإخضاعها لتقنية SDS-PAGE لتحليل تأثير تركيزات IPTG المختلفة على التعبير البروتيني، ثم اختيار تركيز IPTG الذي يحقق أكبر تعبير بروتيني.
بعد إجراء التجارب، تبيّن أن تركيز IPTG ليس مرتفعًا جدًا. ويعود ذلك إلى سمية IPTG للبكتيريا، إذ أن تجاوز هذا التركيز قد يؤدي إلى موت الخلية. عمومًا، نسعى لزيادة كمية البروتين الذائب في الخلية، ولكن في كثير من الأحيان، يؤدي ارتفاع تركيز IPTG إلى تكوّن تجمعات بروتينية كبيرة، مما يقلل من كمية البروتين الذائب. لذا، غالبًا ما يكون التركيز الأمثل لـ IPTG ليس الأعلى، بل الأقل.
يهدف تحفيز وتنمية السلالات المعدلة وراثيًا إلى زيادة إنتاج البروتين المستهدف وخفض التكاليف. لا يتأثر التعبير عن الجين المستهدف بعوامل السلالة نفسها وبلازميد التعبير فحسب، بل يتأثر أيضًا بظروف خارجية أخرى، مثل تركيز المحفز ودرجة حرارة التحفيز ومدته. لذا، يُنصح عمومًا، قبل التعبير عن بروتين غير معروف وتنقيته، بدراسة مدة التحفيز ودرجة الحرارة وتركيز IPTG لاختيار الظروف المناسبة والحصول على أفضل النتائج التجريبية.
تاريخ النشر: 31 ديسمبر 2021