يعتبر ثنائيثيوثريتول (DTT) عامل اختزال شائع الاستخدام، ويُعرف أيضًا باسم المادة المضافة الخضراء الجديدة.وهو مركب عضوي جزيئي صغير يحتوي على مجموعتين من مركبتان (-SH).نظرًا لخصائصه المختزلة واستقراره، يستخدم DTT على نطاق واسع في تجارب الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.
يتمثل الدور الرئيسي لـ DTT في تقليل روابط ثاني كبريتيد في البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى.تعد رابطة ثاني كبريتيد جزءًا مهمًا من طي البروتين واستقراره، ولكن في ظل ظروف تجريبية معينة، مثل تحليل SDS-PAGE القابل للاختزال وإعادة تركيب البروتين وطيه، من الضروري تقليل رابطة ثاني كبريتيد إلى مجموعتين من الثيول لكشف البنية المكانية للبروتين. البروتين.يمكن أن يتفاعل DTT مع روابط ثاني كبريتيد لاختزالها إلى مجموعات مركبتان، وبالتالي فتح البنية المكانية للبروتين وتسهيل تحليله ومعالجته.
يمكن أيضًا استخدام DTT لحماية نشاط الإنزيم واستقراره.في بعض التفاعلات المحفزة بالإنزيم، قد يتم تقليل نشاط الإنزيم بواسطة المادة المؤكسدة.يمكن أن يتفاعل DTT مع المواد المؤكسدة لتحويلها إلى مواد غير ضارة، وبالتالي حماية نشاط واستقرار الإنزيم.
بالمقارنة مع عوامل الاختزال التقليدية مثل β-المركابتويثانول (β-ME)، يعتبر DTT عامل اختزال أكثر أمانًا واستقرارًا.إنه ليس مستقرًا في المحلول المائي فحسب، بل يحافظ أيضًا على خصائصه المختزلة في ظل درجات الحرارة المرتفعة والظروف الحمضية القاعدية.
استخدام DTT بسيط نسبيًا.بشكل عام، يتم إذابة DTT في المخزن المؤقت المناسب ومن ثم إضافته إلى النظام التجريبي.يجب تحديد التركيز الأمثل لـ DTT وفقًا للتجربة المحددة، ويستخدم بشكل عام في نطاق 0.1-1 مم.التركيزات المنخفضة يمكن أن تقلل من الآثار الضارة على نمو الخلايا ويمكن أن تقلل من السمية الخلوية بسبب الإفراط في التعبير عن البروتينات المستهدفة.قد تسبب التركيزات الأعلى عبءًا استقلابيًا مفرطًا للخلية، مما يؤثر على نمو الخلايا وكفاءة التعبير.
يمكن أن تكون طريقة تحديد التركيز الأمثل هي تقييم مستوى التعبير عن البروتين المستهدف عن طريق إجراء اختبارات تحريض IPTG بتركيزات مختلفة.يمكن إجراء اختبارات الثقافة على نطاق صغير باستخدام مجموعة من تركيزات IPTG (على سبيل المثال 0.1 ملم، 0.5 ملم، 1 ملم، وما إلى ذلك) ويمكن تقييم تأثير التعبير بتركيزات مختلفة عن طريق الكشف عن مستوى التعبير للبروتين المستهدف (على سبيل المثال الغربي كشف لطخة أو مضان).وفقا للنتائج التجريبية، تم اختيار التركيز ذو أفضل تأثير التعبير باعتباره التركيز الأمثل.
بالإضافة إلى ذلك، يمكنك أيضًا الرجوع إلى الأدبيات ذات الصلة أو تجربة المختبرات الأخرى لفهم نطاق تركيز IPTG الشائع الاستخدام في ظل ظروف تجريبية مماثلة، ثم تحسينه وضبطه وفقًا للاحتياجات التجريبية.
من المهم ملاحظة أن التركيز الأمثل قد يختلف تبعاً لأنظمة التعبير المختلفة والبروتينات المستهدفة والظروف التجريبية، لذلك من الأفضل تحسين كل حالة على حدة.
باختصار، DTT هو عامل اختزال شائع الاستخدام ويمكن استخدامه لتقليل روابط ثاني كبريتيد في البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى ولحماية نشاط الإنزيم واستقراره.وقد تم استخدامه على نطاق واسع في تجارب الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية.
وقت النشر: 28 سبتمبر 2023